• 強大的基因組編輯工具——Crisp/cas9

    發布者:艾美捷科技發布時間:2020-08-21

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          關于Crisp/cas9,這個是目前研究的一個大熱門,相關的文章和技術解析層出不窮,大家對什么是Crisp/cas9應該也有了一定的了解,今天就跟大家簡單的介紹一下相關的產品吧。不過首先,我們還是再過一遍Crisp/cas9的相關概念吧。

     

           一、 相關概念

     

        (1)CRISPR/Cas是什么?CRISPR是細菌中成簇存在的具有規律間隔的短回文重復序列,是細菌和古細菌在長期演化過程中形成的一種適應性免疫防御,可用來對抗入侵的病毒及外源DNA。cas 的全稱是CRISPR associated protein,它是一種通過crRNA引導的DNA內切酶,如果DNA底物與引導RNA互補,Cas就會裂解入侵的外源DNA。

        (2)CRISPR和Cas9共同組成了一套系統 ,CRISPR識別外源入侵的DNA,cas9負責剪切。是細菌或者古細菌的天然防御系統。而現今,被人類利用進行基因組編輯、轉錄擾亂、基因敲除、表觀遺傳調控等。

        (3)CRISPR-Cas系統的高效基因組編輯功能已被應用于多種生物,包括斑馬魚、小鼠、大鼠、秀麗隱桿線蟲、植物及細菌。多個科研小組的研究都顯示,與鋅指核酸酶(ZFNs)和轉錄激活樣效應核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases, TALEN)相比較,CRISPR-Cas系統介導的基因組靶向實驗在細胞或斑馬魚中具有相似甚至更高的效率。

    CRISPR-Cas系統

    圖1來源https://www.jianshu.com/p/1e7bff7d5830

     

           二 、作用機理

     

          II型CRISPR系統中,CRISPR RNA(crRNA)與轉錄激活crRNA(Trans-activating crRNA, tracrRNA)退火形成的復合物能特異識別基因組序列,引導Cas9核酸內切酶在目的片段生成DNA雙鏈斷裂(double-strand breaks, DSBs)。 這個識別復合體可以通過融合crRNA與tracrRNA序列形成sgRNA(single-guided RNA)進行簡化;蚪M的靶序列中有長約20bp的片段與crRNA或sgRNA互補配對;靶序列末端的三核苷酸區域PAM(5’-NGG-3’)為Cas9識別位點,是實現剪切功能的關鍵。而通過人工設計這兩種RNA,可以改造形成具有引導作用的gRNA (guide RNA) 足以引導Cas9 對DNA的定點切割。

    CRISPR/Cas9介導的基因組編輯原理圖

    圖2 CRISPR/Cas9介導的基因組編輯原理圖

     

          通過介紹,我們了解了Crisp/cas9發揮切割作用的是cas9,起識別作用的是融合crRNA與tracrRNA序列形成sgRNA。因此,要想做好Crisp/cas9這個實驗,我們必須要準備的試劑必須涉及sgRNA和cas9蛋白兩大方面。

     

           三、 產品推薦

     

          針對sgRNA和cas9,我們有如下產品可供選擇哦:

     

          1.sgRNA系列。

     

         (1)sgRNA載體類型

     

    貨號 載體 啟動子 sgRNA 是否含有Cas9核酸酶基因 篩選標記/報告基因
    SG001 pCRISPR-SG01 U6 1 或多個 無,Cas9克隆單獨出售 Hygromycin
    SG002 pCRISPR-LvSG03 U6 1 或多個 無,Cas9克隆單獨出售 Puromycin / mCherry
    SG012 pCRISPR-CG02 U6 1 有,載體含有CBh啟動子啟動表達的Cas9核酸酶基因 N/A
    SG013 pCRISPR-CG04 U6 1或多個 有,載體含有CMV啟動子啟動表達的Cas9核酸酶基因 Neomycin / copGFP
    SG014 pCRISPR-CG07 U6 1 有,載體含有CBh啟動子啟動表達的Cas9核酸酶基因 copGFP
    SG015 pCRISPR-CG08 U6 1 有,載體含有CBh啟動子啟動表達的Cas9核酸酶基因 mCherry
    pCRISPR-CG12 U6 1或多個 有,載體含有CMV啟動子啟動表達的Cas9核酸酶基因 Neomycin / mCherry

     

          *配合單獨表達Cas9 核酸酶(Cat.No. CP-C9NU-01, CP-LvC9NU-01, CP-LvC9NU-02, CP-LvC9NU-08, CP-LvC9NU-09, CP-LvC9NU-10)或 Cas9 D10A切口酶(Cat.No.CP-C9NI-01, CP-C9NI-02) 的 Cas9克隆使用。

     

          還有有上述貨號對應搭配使用的sgRNA亂序對照哦

     

    貨號 產品 篩選標記 報告基因
    CCPCTR01-CG02 Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG02. Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG02. N/A
    CCPCTR01-CG04 Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG04 Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG04
    CCPCTR01-CG07 Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG07 Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG07
    CCPCTR01-CG08 Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG08 Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG08 with mCherry
    CCPCTR01-LvSG03 Scrambled sgRNA control for pCRISPR-LvSG03 Scrambled sgRNA control for pCRISPR-LvSG03 mCherry
    CCPCTR01-SG01 Scrambled sgRNA control for pCRISPR-SG01 Scrambled sgRNA control for pCRISPR-SG01 N/A

       

         (2)還有sgRNA亂序對照慢病毒顆粒

     

    貨號 產品 描述 啟動子 篩選標記 sgRNA
    LPP-CCPCTR01-LvSG03-100 sgRNA 對照 CCPCTR01-LvSG03 的純化慢病毒顆粒(25 µL×4管) 108 TU/ml sgRNA 對照 CCPCTR01-LvSG03 的純化慢病毒顆,轉導級 EF1a Puromycin CCPCTR01-LvSG03
    LPP-CCPCTR01-LvSG03-400 sgRNA 對照 CCPCTR01-LvSG03 的純化慢病毒顆粒(100µL,25 µL×16管) 108 TU/ml sgRNA 對照 CCPCTR01-LvSG03 的純化慢病毒顆,轉導級 EF1a Puromycin CCPCTR01-LvSG03

     

    HUWEI基因

    HUWEI-sgRNA/Cas9

          圖3. HUWEI-sgRNA/Cas9靶向HEK293T細胞中的HUWEI基因。(A)HUWEI-sgRNA與基因組PCR引物設計;(B)在6孔板中,HUWEI-sgRNA/Cas9克隆與sgRNA/Cas9對照克。ㄓ镜2)轉染HEK293T細胞。轉染40h后收集細胞,提取基因組DNA并用HUWE特異的PCR引物進行PCR擴增,凝膠純化PCR產物,將純化后的產物與緩沖液混勻,經變性、退火后在37℃水浴下T7 ENI剪切60min。HUWEI經PCR后的產物片段長度應為520bp,T7 ENI剪切后的產物應分別為330bp和190bp。

     

     CRISPR-Cas9多重靶向編輯多個基因

          圖4. CRISPR-Cas9多重靶向編輯多個基因。實驗組(1-4泳道)為Cas9表達克隆及分別表達靶向p53, HUWE1, NCL3 和 GFP基因的sgRNA克隆質粒共轉染HEK293t GFP穩轉細胞。對照組(5-8泳道)為Cas9表達克隆質及隨機sgRNA表達克隆的質粒共轉染HEK293t GFP穩轉細胞。通過T7核酸內切酶檢測分析基因組DNA各個靶點上同時存在的插入缺失。*號標記的條帶顯示Cas9核酸酶及分別靶向多個靶點的sgRNA都在目標靶點上有效地誘發了插入缺失突變(1-4道)。PCR產物條帶及T7核酸內切酶酶切產物條帶大。篏FP: 720bp (完整), 340bp + 380bp (酶切); NCL3: 765bp (完整), 295bp +470bp (酶切); HUWE: 520bp (完整), 190bp + 330bp (酶切); P53: 825bp (完整), 475bp + 350bp (酶切).

     

         (3)sgRNA 文庫

     

     

    sgRNA 文庫

          圖5. A:混合文庫篩選。對感染了sgRNA混合文庫的細胞株進行篩選,獲取具備目的表型的陽性細胞株進行Sanger測序識別對應的sgRNA,或通過深度測序搜索比例過高或過低的sgRNA。B:使用 sgRNAs 文庫array(獨立克隆文庫)進行基因敲除篩選。各板孔里的細胞株分別感染不同的sgRNA慢病毒顆粒,并篩選具備目的表型的陽性細胞株。如此無需測序即可獲知與目的表型相關的sgRNA。

     

          人類 sgRNA 文庫相關產品

     

    貨號 文庫 sgRNA 數目 基因數目 管數 載體
    L01-LS03 Innate kinases & ubiquitin ligases 475 239 4 管,每管 118-119 個 sgRNA pCRISPR-LvSG03
    L02-LS03 Nuclear hormone receptors 236 118 2 管,每管118 個 sgRNA pCRISPR-LvSG03
    L03-LS03 Tumor metastasis genes 114 57 2 管,每管 57 個 sgRNA pCRISPR-LvSG03
    L04-LS03 Oncogenes 576 288 4 管,每管 144 個 sgRNA pCRISPR-LvSG03
    L05-LS03 Tumor suppressor genes 462 231 4 管,每管 115-116 個 sgRNA pCRISPR-LvSG03
    L06-LS03 Protein kinases 1316 658 10 管,每管 130-131 個 sgRNAs pCRISPR-LvSG03
    L07-LS03 Key genes in 50 pathways 278 139 2 管,每管 139 個sgRNA pCRISPR-LvSG03

           2.Cas9系列產品

     

          (1)Cas9表達克隆產品

     

    貨號 產品 啟動子 報告基因
    Cas9核酸酶表達克隆
    CP-C9NU-01 Cas9核酸酶表達克隆 CMV mCherry / Neomycin
    Cas9核酸酶慢病毒表達克隆
    CP-LvC9NU-01 Cas9核酸酶慢病毒表達克隆 CMV Neomycin
    CP-LvC9NU-02 Cas9核酸酶慢病毒表達克隆 CMV eGFP / Neomycin
    CP-LvC9NU-08 Cas9核酸酶慢病毒表達克隆 EF1a Puromycin
    CP-LvC9NU-09 Cas9核酸酶慢病毒表達克隆 EF1a eGFP / Neomycin
    CP-LvC9NU-10 Cas9核酸酶慢病毒表達克隆 EF1a eGFP / Hygromycin
    Cas9 D10A 切口酶表達克隆
    CP-C9NI-01 Cas9 D10A 切口酶表達克隆 CBh N / A
    CP-C9NI-02 Cas9 D10A 切口酶表達克隆 CMV mCherry / Neomycin

       

        (2)慢病毒顆粒類產品

     

    貨號 產品 描述 啟動子 報告基因
    LPP-CP-LvC9NU-01-100 Cas9 核酸酶純化 Lentifect™ 慢病毒顆粒 1×10^6 – 1×10^7 TU/ml Cas9 核酸酶慢病毒顆粒,轉導級,100 µL. CMV Neomycin
    LPP-CP-LvC9NU-02-100 Cas9 核酸酶純化 Lentifect™ 慢病毒顆粒  

     

    1×10^6 – 1×10^7 TU/ml Cas9 核酸酶慢病毒顆粒,轉導級,100 µL.

    CMV eGFP/Neomycin
    LPP-CP-LvC9NU-10-400 Cas9 核酸酶純化 Lentifect™ 慢病毒顆粒 不低于1×10^7 TU/ml Cas9 核酸酶慢病毒顆粒,轉導級,400 µL. EF1α eGFP/Hygromycin
    LPP-CP-LvC9NU-08-100 Cas9 核酸酶純化 Lentifect™ 慢病毒顆粒 不低于1×10^7 TU/ml Cas9 核酸酶慢病毒顆粒,轉導級,100 µL. EF1α Puromycin

         

         (3)GeneHero™ Cas9 穩定表達細胞系

     

    新貨號 產品 細胞系 Cas9 整合位點 產品規格
    SL501 穩定表達 Cas9 核酸酶基因的人類 H1299 單克隆細胞系 H1299 AAVS1 1管,每管細胞數2×106
    SL502 穩定表達 Cas9 核酸酶基因的人類 HEK293T 單克隆細胞系 HEK293T AAVS1 1管,每管細胞數2×106
    SL503 穩定表達 Cas9 核酸酶基因的 人類 HeLa 單克隆細胞系 HeLa AAVS1 1管,每管細胞數2×106
    SL520 穩定表達 Cas9 核酸酶基因的人類AGS單克隆細胞系 AGS 隨機整合 1管,每管細胞數2×106
    SL522 穩定表達 Cas9 核酸酶基因的人類SNU475單克隆細胞系 SNU475 隨機整合 1管,每管細胞數2×106

         

         (4)GeneHero™ Cas9蛋白類產品

     

    貨號 規格 產品
    GE001 25μg 重組Cas9蛋白含NLS
    GE002 100μg 重組Cas9蛋白含NLS
    GE003 25μg 重組Cas9蛋白含NLS和C-terminal 6x His-tag
    GE004 100μg 重組Cas9蛋白含NLS和C-terminal 6x His-tag

     

    使用HUWE DNA片段作為切割模板

          圖6. 使用HUWE DNA片段作為切割模板。針對HUWE基因設計3個sgRNA,分別與Cas9蛋白孵育后進行下一步切割實驗。紅點標注為切割后的DNA條帶,Ct為未切割的HUWE DNA片段

     

    使用HUWE DNA片段作為切割模板

          圖7. 使用HUWE DNA片段作為切割模板。sgRNA與Cas9蛋白孵育后進行切割實驗。GeneHero™ Cas9蛋白(3-5列)與IDT Alt-R® Cas9蛋白(6-7列)分別進行250ng,100ng和50ng稀釋反應。紅箭頭標注為切割后的DNA條帶,1列反應中只有Cas9,2列反應中只有sgRNA。

     

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