• 告別“黑白”,迎接“彩色”,熒光WB,你值得擁有

    發布者:艾美捷科技發布時間:2020-08-26

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           說起免疫印跡(Western Blot)檢測,想必大家都很熟悉了,不就是WB嗎?每天都做啊,白底黑帶,但是最近經常閱讀SCI文獻(特別是高分的)小伙伴可能會發現,近兩年發表很多高影響因子的文獻的WB結果圖發生了大變樣:白底變成了黑底,條帶從黑色變成了:紅,橙,黃,綠,藍等各種顏色了(如下),條帶亮度,對比度都好了很多了,不同蛋白還能呈現出不同顏色的條帶,很多同學可能會問,這是什么黑科技?是用分析軟件設置的顏色嗎?還是PS軟件P出來的了?

     

    免疫印跡檢測

     

           其實都不是,這是最近比較火的免疫印跡黑科技——熒光WB技術,這不,很多同學還在實驗室中苦逼的跑著WB,“為啥背景那么深?為啥沒有目的條帶?為啥分子量不對?為什么對比度這么低?哀怨聲此起彼伏的時候,殊不知,免疫印跡領域已經發生著一場由“黑白”到“彩色”的光影革命。

     

           熒光WB產生背景:

     

          盡管大多數生命科學研究者采用化學發光底物進行檢測,但由于對多重分析的需求不斷增加,現在越來越多的國外科學家開始使用熒光檢測法。目前國內實驗室使用較多的仍是化學發光,而SCI期刊中則有很多已經使用熒光標記WB了,為了緊跟時代的步伐,我們需要引進和創新。

     

          常見Western Blot顯色的方法主要有:放射自顯影、底物化學發光ECL、底物DAB呈色,熒光WB實驗步驟跟傳統WB差異不大,最主要的差別在于二抗:傳統WB檢測二抗是酶標記,而熒光WB的二抗是熒光標記的,省去了繁雜的顯影,照膠等步驟,取而代之的是利用熒光成像儀直接成像。

     

    常規WB和熒光WB原理對比

     

    常規WB和熒光WB原理對比

      

          說了這么多,那熒光WB到底好在哪了?

     

           熒光WB的優勢:

     

          化學發光的信號是動態的,二抗是酶標記,屬于酶促動力學反應,信號隨時間的變化而變化,信號不與目標蛋白濃度成線性比例關系。而熒光信號熒光是靜態信號,不會隨著時間的變化而變化,信號持久,可達到精準定量。

     

          1.靈敏度更高

     

          熒光免疫印跡已被證明比傳統化學發光印跡更敏感,這是因為IR區域膜上的低背景熒光產生高的信噪比。配備有光電倍增管(PMT)的激光掃描成像儀對印跡進行成像,并可以將弱信號放大幾個數量級。

     

          2.通過復用提高量化精度

     

          使用雙色檢測方法可以同時檢測相同印跡上的兩種抗原。例如,您可以分析您感興趣的蛋白,并利用內參蛋白(例如GAPDH,肌動蛋白)將其均一化,而無需剝離/重新檢測印跡或運行單獨的凝膠。因此,您的量化將更準確。

     

    雙色檢測

       

    雙色檢測

     

     

          3.廣泛的線性動態范圍用于定量測量

     

          為了確?煽康亩繙y量,您從western blot獲得的信號必須在線性動態范圍內。這意味著信號強度與目標蛋白質豐度呈線性相關。換句話說,信號強度的兩倍增加意味著目標蛋白質水平增加了兩倍。通過激光成像儀獲得的靜態熒光值是定量的。這是因為熒光強度與幾個數量級的蛋白質豐度成正比。這提供了廣泛的線性范圍。您可以在相同設置下量化低豐度和高豐度蛋白質,而不用擔心信號飽和或超出線性范圍。

    相比之下,X射線膠片的動力學酶-底物反應和信號飽和將化學發光檢測的線性度限制在更小的范圍內。您經常需要嘗試各種曝光以獲得差異表達蛋白質的“正確圖像”。這是為了確保捕獲的信號在線性范圍內。

     

          4.一致性和可重復性

     

          熒光信號是僅取決于目標抗原的量的靜態值,而許多變量影響通過膜曝光獲得的化學發光信號。一些變量(例如,酶底物反應)難以控制導致不一致和不可重復的結果。 Schutz-geschwender等(2004)報道了熒光蛋白印跡實驗重復的標準偏差遠遠小于化學發光檢測。因此,為了確保您的免疫印跡結果的重復性和準確性。

     

          5.信號持續時間

     

    熒光信號非常穩定。您可以將您的印跡存儲在冰箱中,并在您準備好后再進行成像。相比之下,如果您正在進行化學發光的免疫印跡,您通常需要馬上開始成像。這是為了避免酶活性降低。

     

           傳統WB和熒光WB的綜合比較:

     


    化學發光法WB 熒光WB
    信號源 酶促反應的間接信號(HRP酶標二抗+ECL顯色) 熒光基團的直接信號(FITC/Dylight/Alexa Fluor熒光二抗)
    信號持續時間 幾分鐘到幾小時 幾天到幾周,避光保存得當可長達一年
    靈敏度 高靈敏度,底物種類多樣(DAB、ECL等)
    例如ECL顯色,HRP酶標二抗1:20000~1:50000
    靈敏度較好
    例如Dylight熒光二抗 1:10000左右
    一致性 印跡間可能存在差異 印跡間的重復性較高
    檢測 膠片、化學發光法成像儀器
    常見凝膠成像儀器均可
    需有合適光源和濾光片的成像儀器,例如li-Cor、Bio-rad、天能等。
    定量 定性及半定量,單通道檢測使標準化較為困難 帶有內部對照的多重分析技術使標準化較易實現
    其他注意事項 相似分子量需要進行剝離和印跡的重新檢測
    曝光時間可以較長
    需要注意避免熒光背景
    由于少量的激發光會穿過濾光片,因此曝光時間更長會導致背景熒光較高
    需要注意避光

     

          話不多說,結果才是硬道理:

     

    傳統WB和熒光WB的綜合比較

     

          骨灰級傳統WB玩家跑出來的條帶應該也就左上角的水平了吧?相較于采用熒光WB隨手一跑的結果(右上圖和下圖),如果你是審稿人,你會pick誰了?

     

    小李子

     

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